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分析方法轉移的儀器系統考量與探討

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分析方法轉移的儀器系統考量與探討

發布日期:2022-06-23 作者:曾文亮 點擊:

分析方法轉移是制藥行業中常見的技術轉移,常見的情形有在分析研發實驗室間的轉移;研發實驗室與QC實驗室間的轉移;樣品生產地點變更時,QC實驗室間的轉移。藥物研發早期,對分析方法轉移的法規要求不高;在研發后期或者商業化階段,方法在QC實驗室之間的轉移,對定性與定量結果的一致性有較高要求。任何結果的偏離要非常小心,否則易產生超限或超趨(OOX)的結果。方法轉移前,如果方法驗證與耐用性的研究比較充分,對方法的認知比較了解,方法轉移時出現檢驗結果偏移時會能有足夠的信息與手段來應對與解決。

方法轉移考察的參數早期通常有精密度與系統適用性數據對比;后期通常會有精密度、準確度和系統適用性等數據對比。精密度和準確度的數據測試,與方法條件與參數設置相關,也與不同實驗室儀器系統密切相關。

本文試著從色譜方法自身、色譜儀器系統部分和儀器系統差異性等內容討論方法轉移的一些常見色譜儀系統的考量與挑戰。

1. 分析方法條件

一個有效成功的分析方法轉移,首先是方法自身處于可控狀態,方法有可控的條件與參數,包括一些操作注意事項。表1是液相色譜方法常見的條件與參數:

表1液相色譜方法常見條件

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方法轉移要考慮的元素有方法程序、樣品配制、化學試劑、樣品配制、其它的設備附件、色譜柱、流動相,以及色譜儀系統。分析方法操作人員也是一個關鍵元素,因為方法的知識交流與傳遞非常重要。一個有經驗的分析人員,對于方法有相當的了解,哪些地方需要特別注意,哪些地方是方法運行的關鍵。在與接收方實驗人員交流與培訓時,這些經驗知識非常重要。方法文件的撰寫需要有經驗的分析人員參與,每一個關鍵操作步驟都有詳盡的描述,否則轉移后樣品配制的操作方式不同,都有可能導致系統適用性結果不同。樣品配制用的化學試劑盡量用同一純度或同一廠家。樣品配制設備,如pH計、吸液槍/管、天平等,需要有實驗室可靠的校驗方可使用。 

進行方法轉移時需要根據藥物的研發階段和方法的需求進行適當的風險評估,如圖1。色譜儀系統、流動相、樣品處理和色譜柱是影響方法使用和轉移的主要因素。

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色譜柱是實驗室間方法轉移差異性的關鍵原因。色譜柱是分析方法的核心元素,它直接影響到系統適用性結果。方法轉移如能嚴格要求采用同一廠家同一型號的色譜柱,可以很大程度減少色譜柱對于方法的影響。常用的C18?C8等硅烷色譜柱,大廠家大品牌的技術很成熟,批次與批次間的差異性很小。同一廠家同一型號的新老色譜柱由于使用時間不同,柱效會有差異,這是不同實驗室間柱效不同的主要原因,因此方法轉移時盡量使用新的色譜柱,減少柱效對方法的影響。在方法轉移前,如有色譜柱耐用性的研究考察,將減少方法轉移的技術困難。

流動相的制備也是方法轉移差異性的主要原因。流動相組成包括水、有機溶劑、緩沖鹽或酸堿添加劑。水與有機溶劑的化學純度影響色譜圖的基線波動與噪音,緩沖鹽與酸堿添加劑的化學純度是色譜圖中出現鬼峰的主要因素。流動相的新鮮制備、pH值的穩定性和微生物的濾除會減少色譜圖中雜質峰的出現,從而確保前后色譜圖的一致性。

流動相的不同制備方式會導致方法的差異性。比如制備一個50/50的甲醇/水的混合溶劑有四種方式:①先加入500ml的水至1000ml的容量瓶中,用甲醇稀釋至1000ml;②先加入500ml的甲醇至1000ml的容量瓶中,用水稀釋至1000ml;③分別使用量筒量取500ml的水與甲醇混合;④分別稱量500g的水與甲醇混合。由于水與甲醇混合時會有放熱的情況,水與甲醇的密度不同,因此這四種方式制備得到的混合溶劑實際組成是有一些差別的。這種差別會導致它作為洗脫劑時洗脫能力不同,從而導致色譜峰的保留差異。

因此在方法文件中要盡可能描述清楚流動相的配制過程、樣品的配制過程和系統適用性溶液的配制過程。雙方實驗室嚴格按照方法程序的要求進行操作,會減少由于操作本身而導致的差異。

流動相的配制過程客觀上會存在一些差異,因此在方法程序上可以設計成色譜系統的多項混合洗脫,使用泵系統進行流動相混合,減少人工配制導致的比例差異。

不同實驗室的色譜儀系統客觀上會存在一些差異,在方法轉移前如能有方法耐用性的研究數據支持,或者參考USP<621>通則,適當調整方法參數,減少這些差別和滿足方法系統適用性的要求。

2. 色譜儀系統的差別

色譜儀系統是方法轉移的重要影響因素,也是導致方法不一致的主要原因。色譜儀是由多個模塊組成,不同模塊有不同型號,實驗室間的色譜儀器客觀上很難保持完全一致,這種差異會導致方法轉移后的差別。方法的使用壽命有時也長于色譜系統,儀器的更新速度也會增加方法一致性的難度。

色譜系統液體流動路徑會影響化合物的保留。這個路徑包括系統管線、進樣器和流動相混合器。管線按內徑分有0.030’’、 0.020’’、 0.010’’、 0.007’’、 0.005’’、 0.0025’’等類型,一般來說,管線內徑的大小對系統的體積影響不大,但內徑不同的管線耐壓能力不同,壓力與流速相關。所以方法的流速與系統的Z大耐壓會決定選擇哪種管線。進樣體積會影響峰形與分離度。極端的進樣體積,如50uL,峰形會變寬、對稱性變差,這是因為樣品在管路中心和壁處的層流速度不同,從而導致化合物被擴散。

色譜的泵系統或者溶劑傳遞系統是方法運行的關鍵因素。常見的有低壓四元混合單泵和高壓二元混合雙泵。等度方法相對簡單,受泵的影響較小。梯度方法較為復雜,流動相在系統中的比例受到泵工作原理的直接影響。低壓混合系統中流動相各種組分在到達泵之前就混合完成;高壓混合系統中每種溶劑通過專門的泵輸送至混合器中,流動相各溶劑比例通過各泵的相對流速來控制。同品牌色譜儀同型號的泵在不同實驗室間基本可以做到重復;不同品牌色譜儀,泵的型號不同,對于梯度方法轉移會帶來挑戰。

色譜儀延遲體積的大小會影響色譜峰保留。延遲體積是從流動相混合器到柱前入口處的流路體積。延遲體積一般在供應商提供的資料中可以查到,也可以通過實驗測試得到,即用兩通代替色譜柱,使用有吸收的物質,設定梯度條件,觀察到的梯度中點與設置的程序梯度中點,兩間的差值為梯度延遲時間,乘以流速即為系統的延遲體積。如圖2.

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延遲體積受流路內徑的影響較小,主要受到色譜儀混合器體積的影響?;旌掀鞔嬖诓煌w積大小的產品,體積大,梯度的延遲效應明顯,復雜的樣品分離會影響較大。

混合器體積會影響系統和色譜柱的平衡時間,還有方法回到初始梯度的時間。這些影響在進行方法轉移時,實驗分析人員需要考慮。

前面提到泵的工作原理,有低壓與高壓混合兩種。在運行梯度方法時,它們的原理是不同的。低壓混合模式是各溶劑通過比例閥和在線混合器,溶劑按比例混合,然后通過單泵的高壓傳輸到系統。高壓混合模式是流動相通過各自的高壓泵,按流速來控制比例,然后在線混合輸出到管路中。在低壓混合系統中,柱活塞與泵頭之間有一定的空間,使得混合溶劑無法全體積輸出至管路中,這部分液體將會對系統體積的大小產生影響,從而增加梯度的延遲時間。

3. 如何保持不同實驗室的色譜儀系統一致性?

方法轉移的目標是要在雙方實驗室得到等效的分析結果。如前所述,如果不同實驗室色譜儀系統是相同的,理論上結果應是一致的??陀^上不同實驗室間的設備會存在差異,比如色譜儀廠家、泵的類型、管線大小、進樣器、柱溫箱和檢測器等,還有分析人員的經驗,實驗室的環境,都可能存在差異性,從而影響方法轉移的等效性結果。

色譜儀溶劑遞送系統是關鍵的影響因素,它影響著系統的延遲體積,Z終會影響梯度保留時間。對于這種影響,有三種解決方式。

一是接收實驗室的梯度程序與初始系統的梯度程序準確地進行調整,使得各峰的保留時間保持一致。這種方式在實際操作中比較復雜的,依賴于方法本身和分析物的復雜性。也可參考USP<621>通則中的相關指南進行操作,但實施起來仍有困難。

二是通過物理性的增加或減少系統延遲體積,以匹配初始系統的延遲體積,如圖3。這種方式的本質是增加或減少混合器的體積或數量,從而調整系統的體積。該方式比較容易操作與實現。


圖3: 改變混合器,調整系統延遲體積

三是調整進樣的時間程序,從而調整方法梯度開始時間。通過在進樣程序中設置進樣的時間,從而達到梯度開始后,進樣仍然可以延緩一段時間后開始,該操作類同于增加了一部分系統體積,從而增加了保留時間。如圖4, 它是整體增加或減少系統的體積,所以相當于整個延遲或加速方法梯度的間隔。

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圖4: 調整梯度開始時間以匹配系統延遲體積

進樣系統在當前分析實驗室中基本實現了全部自動化。即由計算機程序控制,不同實驗室間的差異很小。不同品牌供應商的進樣原理可能不同,大部分是定量環加六通閥,加上洗針程序基本可以消除樣品殘留的影響,所以不同實驗室進樣系統對方法的轉移影響較小。

柱溫對于分析方法是一個重要參數,柱溫的控制對方法轉移非常重要,它影響色譜峰保留與選擇性。通常同品牌的柱溫控制箱原理是一樣的,不同品牌的柱溫控制箱會存在差異,它們都有各自的專利保護。柱溫控制箱主要包括溫度傳感器、加熱元件、隔熱材料、漏液檢測、空氣循環、進風和出風系統、溶劑預熱等組件。這些組成部分,溶劑預熱會影響色譜峰的保留與選擇性,如圖5。因此不同品牌的色譜儀,要關注柱溫箱的控制設置,盡量保持一致的參數設置,減少柱溫對方法的影響。

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圖5: 方法轉移時的流動相預熱

檢測器也是影響方法轉移的一個因素,商品化常用的紫外檢測器有單波長的UV或者全波和的PDA檢測器。方法轉移時檢測器帶寬或分辨率設置盡量保持一致,時間常量或濾波器保持一致。不同品牌檢測器的流通池會不一樣,流通池的體積會影響色譜峰峰寬,從而影響色譜峰峰高。選擇同體積的流動池,會減小對色譜峰的影響。

小結

本文主要以色譜方法為例,討論了方法轉移時需要關注的一些情況。方法與化合物的自身復雜性特點會影響方法轉移的難度,同時討論了色譜儀硬件系統在方法轉移時的影響以及常見的解決方式。

(作者簡介:曾文亮,從事新藥質量控制和分析研發工作,個人公眾號:文亮頻道)

 

參考文獻:

1. Instrument Considerations in the Transfer ofChromatographic Methods, Part I: Method Considerations,LCGC North America,  2018, Volume36, Issue 9,Pages: 693–696.

2. Instrument Considerations in the Transfer ofChromatographic Methods, Part II: System Considerations,LCGC North America,  2018, Volume36, Issue 11, P824-829.

3. InstrumentConsiderations in the Transfer of Chromatographic Methods, Part III: AligningPerformance of Modules,LCGC NorthAmerica, 2019, Volume 37, Issue 3, P185–191


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